دانشکده علوم زراعی
پایان نامه دوره دکتری در رشته اصلاح نباتات
موضوع:
بررسی تنوع آللی ژنهای کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام جو
اساتید راهنما:
دکتر نادعلی بابائیان جلودار
دکتر سید مجتبی خیام نکوئی
اساتید مشاور:
دکتر محسن مردی
دکتر بابک ناخدا
نام دانشجو:
راحله خادمیان
شهریور ماه 1391
الف
سپاسگزاری
سپاس بی کران پروردگار یکتا را که هستیمان بخشید و به طریق علم و دانش رهنمونمان شد و به همنشینی رهروان علم و دانش مفتخرمان نمود و خوشه چینی از علم و معرفت را روزیمان ساخت.
از پدر و مادر عزیزم، این دو معلم بزرگوارم، که همواره بر کوتاهی و درشتی من، قلم عفو کشیده و کریمانه از کنار غفلت هایم گذشته اند و من پیوسته جرعه نوش جام تعیلم و تربیت ، فضیلت و انسانیت آنها بوده ام و همواره چراغ وجودشان روشنگر راه من در سختی ها و مشکلات بوده است، کمال تشکر و قدردانی را دارم. از همسر عزیزم که سایه مهربانیش سایه سار زندگیم می باشد، او که اسوه صبر و تحمل بوده و مشکلات مسیر را برایم تسهیل نمود بی نهایت سپاسگزارم. از خواهران عزیز و برادر مهربانم که با حمایت های همه جانبه خود مشوق من در امر تحصیل بودهاند قدردانی و تشکر مینمایم و برایشان آرزوی سلامت و سعادت دارم.

از استاد با کمالات و شایسته؛ جناب آقای دکتر نادعلی بابائیان جلودار که در کمال سعه صدر، با حسن خلق و فروتنی، از هیچ کمکی در این عرصه بر من دریغ ننمودند، همچنین از استاد گرانقدر جناب آقای دکتر سید مجتبی خیام نکوئی که علی رغم مشغله فراوان کاری با روی گشاده پذیرای من شدند و مشترکاً زحمت راهنمایی این رساله را بر عهده گرفتند، از استاد فرزانه و دلسوز، جناب آقای دکتر محسن مردی و استاد فرهیخته؛ جناب آقای دکتر بابک ناخدا که زحمت مشاوره این رساله را در حالی متقبل شدند که بدون مساعدت ایشان، این پروژه به نتیجه مطلوب نمی رسید؛ بسیار متشکر و سپاسگزارم.
از اساتید محترم داور جناب آقایان دکتر رنجبر، دکتر کاظمی تبار، دکتر باقری و دکتر دلجو که زحمت داوری این رساله را متقبل شدند؛ کمال تشکر و قدردانی را دارم. از مدیریت محترم گروه زراعت و اصلاح نباتات جناب آقای دکتر نجفی، مسئول دفتر گروه جناب آقای اکبری و سایر اساتید گروه زراعت و اصلاح نباتات که هموراه از مساعدت و همکاری آنها در طول دوران تحصیل برخوردار بوده ام تشکر می نمایم. از دوستان بسیار عزیز و همکلاسی هایم که کمک و همراهی آنها در پیمودن این مسیر مرا یاری نموده است بسیار سپاسگزارم.

ب
تقدیم به
ت
چکیده:
اطلاعات زیادی در مورد توالی بسیاری از ژن ها بدون آنکه عملکرد آن ها شناخته شده باشد، وجود دارد. از این رو تحقیقات فراوانی از طریق روشهای معکوس ژنتیکی برای پر کردن شکاف بین ساختار و عملکرد این توالیها انجام گرفته است. تحقیق حاضر با هدف تعیین تنوع آللی ژنهای کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام و ژنوتیپهای جو در سطح تک نوکلئوتید (SNP)، جستجوی آللهای جدید، آنالیز روابط فیلوژنی میان ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از تنوع نوکلئوتیدی، و طبقهبندی ژنوتیپهای آزمایشی در قالب گروههای هاپلوتیپی انجام گرفته است. در این تحقیق از 96 ژنوتیپ جو که در مناطق مختلف شور در جهان از جمله ایران کشت میگردند، به عنوان مواد گیاهی استفاده گردید. این تحقیق با همکاری مرکز بینالمللی تحقیقات کشاورزی در مناطق خشک (ICARDA) و پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران- کرج (ABRII) انجام گرفته است. ژنهای مورد مطالعه شامل دو ژن مقاوم به شوری در جو، CBL4 و HKT1، بوده است. از تکنیک اکوتیلینگ به کمک توالییابی برای یافتن تنوع آللی در این ژنها در سطح تک نوکلئوتید استفاده شده است. نتایج حاصل از این آزمایش فراوانی نسبی موتاسیون تک نوکلئوتیدی در این ژنها را به ترتیب 9/17 SNP/Kb و 137 SNP/Kb در HKT1و CBL4 نشان داده است. مجموع موتاسیونهای مشاهده شده در ژن CBL4 بیش از ژن HKT1 بوده اما تعداد موتاسیونهای هموزیگوت، که دارای اهمیت بسیار زیادی در مطالعات ژنتیکی میباشند، در ژن HKT1 اندکی بیشتر از ژن CBL4 بوده است. روابط فیلوژنی میان ژنوتیپها در بررسی ژن HKT1 بیانگر وجود قرابت ژنتیکی زیاد میان آنها بوده است. در حالی که، مطالعه این روابط در ژن CBL4 وجود درختهای فیلوژنی مجزا برای هر کانتیگ از این ژن و تفاوت ژنتیکی نسبتاً زیاد بین ژنوتیپهای مورد مطالعه را نشان داده است. آنالیز هاپلوتیپی ژنهای CBL4 و HKT1، عدم گروهبندی هاپلوتیپی در ژن HKT1 و وجود سه گروه هاپلوتیپی مجزا در ژن CBL4 را نشان داده است. پنج ژنوتیپ از مجموع هفت ژنوتیپی که در این سه گروه هاپلوتیپی قرار گرفتهاند متعلق به ایران میباشند. گروه هاپلوتیپی اول متشکل از سه ژنوتیپ، دو ژنوتیپ ایرانی و دیگری رقم شاهد، میباشد. رقم شاهد در این تحقیق، رقم کلیپر جو، یک رقم بسیار مقاوم به شوری است. بنابراین استنباط میگردد که این دو رقم ایرانی نیز دارای سطح بالایی از مقاومت به شوری باشند. همچنین طبقهبندی ژنوتیپهای ایرانی در گروههای مختلف هاپلوتیپی نشان دهنده وجود تنوع ژنتیکی معنیدار بین ارقام ایرانی است که دارای اهمیت ژنتیکی بسیار زیادی میباشد. آنالیز هر دو ژن در ژنوتیپهای مورد آزمایش در این تحقیق وجود رابطه ژنتیکی بسیار نزدیک بین ارقام ایرانی به استثنای چند مورد را نشان داده است. دلیل این امر منشأ ژنتیکی بسیار متفاوت این ارقام ایرانی بوده است. همچنین، از میان ارقام خارجی، ارقامی که متعلق به کشور لیبی و مقاوم به شوری بودهاند رابطه ژنتیکی بسیار نزدیکی با ارقام ایرانی نشان داده و در اکثر موارد در یک گروه اصلی و یا حتی در یک زیر گروه با ارقام ایرانی قرار گرفتهاند. بنابراین میتوان استنباط نمود که این ارقام قرابت ژنتیکی زیادی با یکدیگر داشته و از نظر فنوتیپی نیز میتوانند سطوح مشابهی از مقاومت به شوری را نشان دهند.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب(به صورت کاملا تصادفی و به صورت نمونه) با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود-این مطالب صرفا برای دمو می باشد

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

کلمات کلیدی: جو، تنوع تک نوکلئوتیدی، مقاومت به شوری، هاپلوتیپ، CBL4، HKT1
ج
فهرست مطالب عنوانصفحهمقدمه1فصل اول- بررسی منابع علمیفصل دوم- مواد و روشها2-1- فرضیات تحقیق 2-2 – مواد گیاهی 2-3 – طراحی پرایمر2-4- مدل ژنی ژنهای استفاده شده برای طراحی پرایمرها 2-5 – مشخصات پرایمرهای طراحی شده 2-6- تهیه نمونه DNAی ژنومی 2-7 – تعیین کیفیت و کمَیَت نمونههای DNA 2-8- واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تست پرایمرها 2-9 – آزمون کارآیی پرایمرهای طراحی شده ….2-10 – واکنش توالییابی 2-11 – آنالیز ژنتیکی دادههای توالییابی فصل سوم- نتایج و بحث 3-1- آنالیزقطعه کامل ژن HKT1 3-2 – آنالیزقطعه کامل ژن CBL4 3-3 – تخمین فراوانی نسبی SNP3-4 – موتاسیونهای هموزیگوت در قطعات کامل توالی …3-5- درخت فیلوژنی ژن HKT1 3-6- درخت فیلوژنی ژن CBL4 3-7- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن HKT1 3-8- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 3-9- آنالیز ژن HKT1 براساس قطعات تکثیری پرایمرها 3-9-1- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1 3-9-1-1 موتاسیونهای حذف و اضافه نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-13-9-1-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1 3-9-2- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-2 3-9-2-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-23-9-2-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-2
ح
فهرست مطالب عنوانصفحه3-9-3- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3 3-9-3-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3 3-9-3-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3 3-9-4- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-4 3-9-4-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-4 3-9-4-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-4 3-10- آنالیز ژن CBL4 بر اساس قطعات تکثیری پرایمرهای این ژن 3-10-1- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 3-10-1-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 3-10-1-2- – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 3- 10-2- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر CBL4-23-10-2-1 موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2 3-10-2-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2 3-10-3- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3 3-10-3-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3 3-10-3-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3 3-10-4- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4 3-10-4-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4 3-10-4-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4 3-11- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3 3-12- نقشههای هضم آنزیمی 3-13- حذف و اضافههای (Indels) نوکلئوتیدی 3-14- آنالیز هاپلوتیپی 3-15- آنالیز هاپلوتیپی 3-16- مشخصات مورفولوژیکی هاپلوتیپها 3-17- بررسی مورفولوژیکی هاپلوتیپها3-18- نتیجه گیری کلی3-19- پیشنهاداتپیوستها:منابع

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

خ
فهرست شکلهاعنوانصفحهشکل 1- شبکه سیگنالدهی CBL-CIPK در پاسخ به تنشهای غیر زندهشکل2- مسیر اختصاصی سیگنال دهی گیاه در پاسخ به تنش شوری شکل 2-1- منطقه کد کننده پروتئین ژن calcineurin B-like protein 4 (CBL4) در رقم Clipper جو شکل2- 2- توالی کامل ژن CBL4 و مشخصات منطقه کد کننده و توالی آمینو اسیدی در این ژن شکل 2-3- مدل ژنی ژن HvHKT1شکل 2- 4 – توالی کامل ژن HvHKT1 و مشخصات منطقه کد کننده و توالی آمینو اسیدی در این ژنشکل 2-5- گیاهچههای 14 روزه که برای تهیه نمونه برگی استفاده شدندشکل 2-6- دستگاه Freezdryer برای خشک کردن نمونههای برگیشکل 2-7- دستگاه گریندر برای پودر کردن نمونههای برگی شکل 2-8- تصویرژل نمونههای DNAشکل 2-9- دستگاه ترموسایکلر مدل ABI Vertri 96شکل 2-10- محصول PCR پنج پرایمر …شکل 2-11- دستگاه ABI3100 برای توالی یابی محصولات PCR و آنالیز ژنتیکیشکل 2-12- نمونهای از کروماتوگرام نمونههای توالییابی شده شکل 3- 1- توالی نوکلئوتیدی قطعه کامل ژن HKT1 شکل 3- 2 – توالی نوکلئوتیدی قطعه ژنی ژن CBL4 شکل 3- 3- درخت فیلوژنی ژن HKT1 شکل 3-4- درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ اولشکل 3- 5 – درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ دومشکل 3-6- درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ سومشکل 3-7- درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگچهارمشکل 3-8- درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ پنجمشکل 3-9- درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ ششمشکل 3- 10- نقشه هضم آنزیمی ژن HKT1 شکل 3- 11- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ اولشکل 3- 12 نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ دومشکل 3- 13- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ سوم شکل 3- 14- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ چهارمشکل 3- 15- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ پنجم
د
فهرست شکلهاعنوانصفحهشکل 3- 16- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ ششمشکل 3- 17- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ هفتمشکل 3- 18- توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1 شکل 3- 19- محل وقوع یک موتاسیون حذف نوکلئوتیدی …شکل 3- 20 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1- 1 شکل 3- 21 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-2 شکل 3- 22 – بخشی از کروماتوگرام ژنوتیپ شماره 9 …شکل 3- 23- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1- 2شکل 3- 24 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3 شکل 3- 25- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3شکل 3- 26 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-4 شکل 3- 27 – کروماتوگرام ژنوتیپهای شماره 81 (شکل بالا) و 91 (شکل پائین) شکل 3- 28 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1- 4 شکل 3- 29- توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر CBL4- 1شکل 3- 30- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 در کانتیگ اولشکل 3- 31 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 در کانتیگ دومشکل 3- 32 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 در کانتیگ سومشکل 3- 33 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2شکل 3- 34 – کروماتوگرام ژنوتیپ شماره 12 که محل وقوع 3 موتاسیون حذفی را نشان میدهدشکل 3- 35- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-23- 36 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2 شکل 3- 37- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3شکل 3- 38 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4شکل 3- 39 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4- 4شکل 3- 40- توالی نوکلئوتیدی هاپلوتیپهای ژن CBL4 در مناطق دارای SNP
ذ
فهرست جدولها عنوانصفحهجدول 2-1- نام و توالی پرایمرهای طراحی شده برای ژنهای HvHKT1 و CBL4جدول 2-2 – مواد مورد نیاز برای واکنش PCR جدول 2-3- مواد مورد نیاز برای انجام دومین واکنش PCR در توالییابی جدول 3-1 – مشخصات انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری ژن HKT1جدول 3-2- مشخصات انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری ژن CBL4 جدول 3-3- مشخصات ژنوتیپهای شاخه اصلی اول در درخت فیلوژنی ژن HKT1جدول 3-4- مشخصات ژنوتیپهای شاخه اصلی دوم در درخت فیلوژنی ژن HKT1جدول 3-5- مشخصات ژنوتیپهای شاخههای اصلی سوم، چهارم، پنجم وششم در درخت فیلوژنی ژن HKT1جدول 3-6 – مشخصات ژنوتیپهای شاخههای اصلی هفتم در درخت فیلوژنی ژن HKT1جدول 3-7- مشخصات ژنوتیپهای شاخههای اصلی هشتم، نهم، دهم، یازدهم و دوازدهم در درخت فیلوژنی ژن HKT1 جدول 3-8- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ اول جدول 3-9- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ دوم جدول 3-10- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ سومجدول 3- 11- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ چهارم جدول 3-12- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ پنجمجدول 3-13- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ ششمجدول 3-14- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن HKT1 جدول 3-15- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ اول جدول 3-16- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ دوم جدول 3-17- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ سوم جدول 3-18- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ چهارمجدول 3-19- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ پنجمجدول 3-20- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه …
ر
فهرست جدولها عنوانصفحه3-21- تعداد موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-1 3-22- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی …3-23- تعداد و انواع موتاسیونهای حذف و اضافه در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-23- 24- تعداد انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-2 3-25- تعداد انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-3 3-26- تعداد انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-43-27- تعداد و انواع موتاسیونهای حذف و اضافه نوکلئوتیدی در کانتیگ های قطعه تکثیری …3-28- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-13-29- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری …3-30- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-23-31- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-33- 32- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ….3-33- تعداد و انواع موتاسیونهای حذف و اضافه نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-43-34- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-43-35- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری …3-36- دسته بندی ژنوتیپها3-37- مشخصات گروه هاپلوتیپی3-38- مشخصات آماری SNPهای بالقوه و واقعی در دسته سوم3-39- مشخصات آماری SNPهای واقعی و هاپلوتیپها در دسته سوم3-40- مشخصات کامل SNPهای بالقوه در دسته سوم3-41- مشخصات مورفولوژیکی سه هاپلوتیپ شناخته شده در آزمایش
ز

مقدمه:
افزون بر 20% از اراضی کشاورزی و نزدیک به نیمی از زمین های آبی در دنیا متأثر از مشکل شوری هستند که این، عامل محدود کننده رشد و نمو گیاهان در سراسر جهان و مشکلی جدی برای تولید محصول کشاورزی میباشد (28). شوری خاک یکی از مهمترین مشکلات محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار میدهد (51). لذا، فهم مکانیسم های تحمل به شوری بسیار با اهمیت است (15). عملکرد گیاهان زراعی تحت تأثیر تنشهای زنده و غیر زنده بیش از 50% کاهش مییابد (146). افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکلاتی مانند 1) عدم تعادل یونی 2) کمبود مواد معدنی 3) تنش اسمزی 4) سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو میگردد (64). این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل مییابد (134) و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش میدهد. تحمل نسبت به شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف) تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب) تنظیم اسمزی و ج) تغییرات مورفولوژیکی میباشد (84). مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل: 1- برنامه های اصلاح کلاسیک که علی رغم برخی موفقیتها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، 2- استفاده از موتاسیونهایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن میگردند برای شناسائی و مطالعه ژنهای مسئول تنش. برای مثال در آرابیدوپسیس، به دلیل سهولت در دستکاری ژنتیکی این گیاه (6)، تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است و 3- روش های کشت آزمایشگاهی در گیاهانی مانند یونجه (154)، برنج (77 و 155) و سیب زمینی (93) میباشد. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک میکند (27). افزایش گیاهان متحمل (124) همراه با مهندسی ژنتیک نتایج خوبی را از نظر احتمال انتقال سریع و دقیق صفات مطلوب به داخل گیاهان مورد نظر، بدون حضور ژن های مضر از خویشاوندان نزدیک گیاه، نشان داده است (111). زیرا در این روش، از انتقال مناطق ناخواسته کروموزومی ممانعت میگردد (112 و 20). استفاده از ظرفیت داخلی گیاه، تحمل آن نسبت به این تنش را تقویت میکند و مهندسی ژنتیک مدرن به انتقال صفات مطلوب کمک مینماید (94).
جو یکی از متحملترین گیاهان زراعی است که طی سالها، از روشهای مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است (149). ذخایر ژنی جوی زراعی در مقایسه با انواع وحشی آن تنوع ژنتیکی محدودی را نشان دادند که این امر بیانگر لزوم توسعه ارقام سازگار میباشد (105). گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد مییابند دارای تنوع ژنتیکی گستردهتری هستند (88). از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است (69). مکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه میباشد (15 و 138). از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی بالایی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساسترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی میباشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش مییابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است (134)، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی میباشد (74). بین تحمل به شوری در دو مرحله رشدی جوانهزنی و گیاهچگی هیچ رابطهای وجود ندارد (74). مکانیسمهای تحمل به شوری در جو شامل موارد زیر است: 1- انتقال یون سدیم از برگهای گیاه جو به داخل واکوئول که موجب کاهش سمَیَت این یون میشود (38) و 2- توزیع بیشتر یون پتاسیم موجود در برگهای جو به داخل سلولهای مزوفیل نسبت به توزیع آنها در سلولهای اپیدرم که موجب افزایش نسبت یونی پتاسیم به سدیم در سیتوپلاسم سلولهای مزوفیل میشود و این وضعیت برای ثبات فتوسنتز با اهمیت است (56).
استراتژیهای حفاظت در مقابل آسیب ناشی از شوری در جو عبارت از استراتژی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است. تغییر عملکرد ژن راهی موثر برای تغییر این وضعیت است. بنابراین یک مرحله اساسی، درک مکانیسم مولکولی پاسخ به تنش است که در این مرحله، ژنهای کنترل کننده تنش و گیاهان ترانس ژنیک دارای تحمل بالا نسبت به این تنش شناسایی می گردند (65).
دو ژن CBL4 و HKT1 نقش مهمی در تحمل گیاه جو نسبت به تنش شوری دارند که نقش و اهمیت آنها به طور خلاصه ذکر میگردد. سیگنالهای حاصل از یون کلسیم، مبدَلها و تنظیم کنندههای اصلی در فرآیندهای سازگاری و نموَی گیاهان هستند. این سیگنالها به واسطه اثرات تحریکی خاص ناشی از فعال شدن همزمان کانالها، پمپها و انتقال دهندههایی که به صورت دمائی و فضایی افزایش یون کلسیم را نشان میدهند، بروز مییابند (59). مشخصترین مسیر سیگنالدهی که مختص تنش شوری است نیز شامل افزایش یون کلسیم در سیتوسول میباشد (161). در این مسیر، افزایش القائی یون سدیم در سیتوسول احتمالاً از طریق یک پروتئین calcineurin B-like به نام CBL4 که اصولاً تحت عنوان SOS3 شناخته شده است، تشخیص داده میشود. کمپلکس CBL4/CIPK24 (SOS3/SOS2) از طریق زنجیره اسید چرب مریستول با CBL4/SOS3 پیوند کووالانسی تشکیل میدهد (Ishitani, 2000) که موجب فسفریلاسیون و در نتیجه فعال شدن آنتی ریپورتر Na+/H+ موجود در بخش مرزی غشاء یعنی SOS1 میگردد (104، 106 و 126). سیستم سیگنالدهی CBL/CIPK برای ترجمه سیگنالهای یون کلسیم به شکل فسفریلاسیون پروتئینی است که کمپلکسهای شرکت کننده در پروتئینهای CBL و CIPK هایی را که با آنها اثر متقابل دارند، مانند AKT1، ترانسپورتر یون پتاسیم در آرابیدوپسیس یا SOS1، عامل حساسیت عمومی نسبت به شوری یا CHL، ترانسپورتر نیترات یا AHA2 و H+ATPase 2 در آرابیدوپسیس، را مشخص میکند (86). چند نوع CBL وجود دارد مانند CBL1، CBL4 و CBL9، که با اعضای غشائی در ارتباط هستند (54 و 68). در مورد CBL4/SOS3، نشان داده شده است که مریستوله شدن برای تحمل به شوری مهم و ضروری بوده است (54). اولین CBL شناخته شده با روش ژنتیکی SOS3/CBL4 بوده است. این نشان میدهد که SOS3/CBL4 در تحمل به شوری از طریق حسگر یون کلسیم دارای نقش اختصاصی میباشد. ژنهایی که گیاه را قادر به محدود کردن تجمع یون سدیم در بافت شاخه مینمایند دارای منابع بالقوهای از تحمل نسبت به شوری در اصلاح نباتات هستند. در جو، لوکوس HvNaX4 مقدار یون سدیم در شاخه را بین 12 و 59 درصد کاهش میدهد. بسته به شرایط هیدروپونیک و نوع خاک تأثیر قوی محیط روی بیان این ژن مشخص میگردد (112). لوکوس ژنی HvCBL4 در جو با ژن متحمل به شوری SOS3 در آرابیدوپسیس همولوگ بوده و با HvNaX4 به طور همزمان تفرق مییابد (112).
تحمل به شوری در گیاهان میتواند وابسته به عامل انتقال دهنده HKT1 باشد که این مولکول اختصاصاً انتقال یونهای سدیم یا انتقال یونهای سدیم و پتاسیم را تسهیل مینماید (86 و132) و در تنظیم هموستازی یون سدیم نقش مهمی ایفاء میکند. در آرابیدوپسیس تالیانا تنها یک ژنHKT (144) و در برنج 8 ژنHKT (33 و 48) وجود دارد. این ژن براساس تشابه توالی آمینو اسیدی دارای دو زیر خانواده میباشد (100) که آنها از نظر انتخاب دو یون سدیم و پتاسیم متفاوت هستند ((33، 48 و 72). اعضای ژنی زیر خانواده اول همگی اجزای انتقال دهنده اختصاصی یون سدیم بوده و اعضای زیر خانواده دوم انتقال دهنده همزمان دو یون سدیم و پتاسیم یا انتقال تک یون سدیم و یا پتاسیم می باشند به استثنای ژن OsHKT2,2 (Oshkt2) در برنج.

شکل 1- شبکه سیگنالدهی CBL-CIPK در پاسخ به تنشهای غیر زنده
محققان گزارش دادند که تحمل نسبت به شوری به طور معنی داری با نسبت یون پتاسیم به یون سدیم مرتبط است (105). آنالیز ترکیبی نشان داد که HvHKT1 اصولاً انتقال یون سدیم را تحت شرایط تنش کنترل میکند، که این نتیجهگیری با آنالیز بیشتر بیان ژن تأیید گردید. همچنین گزارش شده است که در جمعیتهایی که در محیط تحت تأثیر تنش رشد مییابند، طیف وسیعی از تنوع ژنتیکی وجود دارد (88). در جو، مطالعه شده است که بیان ژن HKT1 به وسیله یون پتاسیم تنظیم میشود (150). همچنین گزارش شده است که خانوادههای ژن HKT در هموستازی یون سدیم نسبت به یون پتاسیم دخالت مینمایند که این نشان دهنده اهمیت آنها در تحمل نسبت به شوری است (43). چند مکانیسم در سازگاریهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی دخالت دارند که احتمالاً در حفظ نسبت پائین یون سدیم به یون پتاسیم در سیتوپلاسم نقش دارند. در جو (هوردئوم وولگار)، دو تا از این مکانیسمها وجود دارد که شامل انتقال یون سدیم به داخل واکوئول در عرض غشای تونوپلاستی و انتقال یون سدیم به محیط خارج در سراسر غشای پلاسمائی میباشد (32 و 99). توزیع درون سلولی یون سدیم شامل پمپاژ این یون به داخل واکوئول قبل از افزایش غلظت آن در سیتوپلاسم است (138). این فرآیند از طریق یک شیب گرادیانت pH که به وسیله جابجایی پروتونی H+-ATPase و پیروفسفاتاز غیر آلی ایجاد میگردد، تسریع میشود (31، 37، 62 و 145). افزایش فعالیت آنتیریپورتر Na+/H+ به دلیل افزایش یون سدیم در ریشههای هوردئوم وولگار گزارش شده است (32). مطالعات متعدد اخیر وجود تنوع در تحمل به شوری در میان ارقام هوردئوم وولگار را گزارش نموده است (66 و 115). تحمل به شوری در گیاهان بستگی به ترانسپورترهای HKT دارد که این ترانسپورترها واسطه انتقال اختصاصی یون سدیم یا انتقال همزمان یون سدیم و پتاسیم هستند. ترانسپورترهای HKT دارای دو نقش میباشند: 1- جذب یون سدیم از محلول خاک برای کاهش یون پتاسیم مورد نیاز هنگامی که یون پتاسیم عامل محدود کننده است و 2- کاهش تجمع یون سدیم در برگها با انتقال آنها به داخل فضای آوند چوبی و یا انتقال آنها به داخل فضای آوند آبکش (113).
شکل2- مسیر اختصاصی سیگنال دهی گیاه در پاسخ به تنش شوری (86)
تکنیک اکوتیلینگ
تعیین خصوصیات فنوتیپی جمعیتهای بزرگ یا مجموعههای بزرگ بانک ژنی مشکل و دشوار است. راهحل آن، استفاده از روشی برای صرفه جوئی در زمان و هزینه میباشد. همچنین، توانایی عملی برای تأیید نقش توالیهای ژنی که از طریق برنامههای بررسی بیان توالی ژن در آزمایشات بزرگ به دست میآیند متناسب با سرعت کشف و یافتن آنها نمیباشد. در نتیجه، تعداد زیادی توالی DNA وجود دارد که از طریق تفسیر الکترونیکی با ژنها یا پروتئینهایی که قبلاً خصوصیات آنها تعیین شده همولوژی ندارند و بدین وسیله هیچ عملکرد بالقوهای برای آنها در نظر گرفته نمیشود (11). به علت وجود اطلاعات زیاد در مورد توالیهای ژنی و فقدان آگاهی از عملکرد و نقش آنها، و نیز برای پر کردن فاصله بین ساختار و نقش این توالیها تحقیقات زیادی در زمینه ژنتیک معکوس انجام گرفته است (64). با استفاده از ابزار مولکولی و ژنتیکی، یک صفت موتانت با یک توالی از DNA که عملکرد آن قبلاً شناخته شده است، مرتبط میگردد (17 و 46). اکوتیلینگ روشی است که با آن میتوان به سرعت و به سادگی پلیمورفیسمهای طبیعی (پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی (SNP) یا حذف و اضافههای کوچک) را در ژن مورد نظر تعیین نمود (16). این تکنیک بر مبنای تشخیص موتاسیون است و اولین بار توسط کومای و همکاران معرفی گردید که در واقع از تکنیک تیلینگ برای یافتن موتاسیون در جمعیت طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا استفاده گردید. این روش برای جو(Hordeum vulgar L.) (76)، هندوانه (Cucumis melo L.) (91)، گندم(Triticum aestivum L.) (152)، بادام زمینی وحشی (Arachis duranensis K & G) (109) و در تعدادی از گیاهان آبزی مانند (Monochoria vaginalis B.)(151) به کار برده شد. با استفاده از این روش، تعیین آللهای مختلف ژنهای هدف و کاهش تعداد نمونههایی که باید تعیین فنوتیپ گردند، امکانپذیر میشود. معمولترین شکل تنوع ژنتیکی SNP است، به خصوص آللهای نادری که فراوانی آنها کمتر از 5% است نقش مهمی در فنوتیپ ایفاء مینمایند. اثرات بسیار مؤثر آللهای نادر روی صفات کمّی و بیماریهای پیچیده در تحقیقات زیادی گزارش شده است (14 و 114). برخی از SNP ها از طریق تغییر توالی آمینو اسید یا ناقص کردن پروتئینها عملکرد ژن را تغییر میدهند (109).
مزیتهای تکنیک اکوتیلینگ شامل موارد زیر است: 1- این تکنیک در همه گیاهان و جانوران، حتی گونههایی که قادر به موتانت زایی نیستند، قابل کاربرد است (35)، 2- قابلیت تعیین تنوع در تعداد تکرار ستلایتها (SSRs) را دارد (139)، 3- قابلیت تعیین سطوح هتروزیگوسیتی در گونههای دگرگشن با هتروزیگوسیتی بالا را دارد (35) و 4- ظرفیت تشخیص پلی مورفیسمهای چند گانه در یک قطعه مجزا را دارد (139). مزایای تکنیکی روش اکوتیلینگ در مقایسه با سایر روشهای مولکولی به این دلیل است که روشهای ارزیابی بر اساس حرکت ژل، مانند الکتروفورز ژل گرادیانت (DGGE) و پلی مورفیسمهای تک رشتهای (SSCP) قادر نیستند محل و نوع پلی مورفیسم در قطعه DNA را تعیین کنند (21). تکنیکهای دنیچره کردن و PCR نیز صرفاً برای قطعات کوچک DNA استفاده میشوند و تکنیک مبتنی بر آرایه میتواند 50% از SNPها را بیابد و در این میان، روش توالییابی برای این منظور بسیار مناسب و دقیق میباشد. این روش در گذشته برای ارزیابی جمعیتهای بسیار بزرگ پر هزینه بود اما امروزه با پیشرفت سریع در تکنیکهای توالییابی به عنوان روشی کم هزینهتر و با راندمان بالاتر و همچنین استفاده از نرم افزارهایی که تجزیه و تحلیل دادههای توالییابی را تسریع و تسهیل میکنند، کاربرد این تکنیک بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است. به گونهای که اخیراً یکی از جدیدترین تکنیکهای تیلینگ و اکوتیلینگ انجام این روشها با استفاده از توالییابی است که با صرف هزینه کمتر و در مدت زمان کوتاهتر برای مطالعه تنوع در ژنهای چند آللی در جمعیتهای موتانت و طبیعی به کار میرود. با استفاده از روش توالییابی، ضمن برخورداری از کلیه مزایای تیلینگ و اکوتیلینگ، میزان سرعت و دقت در یافتن پلی مورفیسمهای تک نوکلئوتیدی و نیز سایر انواع پلی مورفیسمها به حداکثر میرسد (35).
هدف از این تحقیق، تعیین تنوع آللی ژنهای کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام و ژنوتیپهای جو، جستجوی آللهای جدید، آنالیز روابط فیلوژنی میان ژنوتیپهای مورد مطالعه، و طبقهبندی ژنوتیپها در قالب گروههای هاپلوتیپی بوده است. بدین منظور، از تکنیک اکوتیلینگ به کمک توالی یابی2 که یک تکنیک مدرن و بسیار کارآ میباشد برای یافتن انواع پلیمورفیسمهای نوکلئوتیدی در دو ژن CBL4 و HvHKT1 (ژنهای کنترل کننده تنش شوری) در ارقام مورد مطالعه جو در این تحقیق استفاده گردیده است. این دو ژن در کنترل شوری نقش بسیار مهم و اساسی دارند. در مطالعه حاضر، از تنوع نوکلئوتیدی این ژنها در ارقام و ژنوتیپهای متعلق به مناطق مختلف شور در دنیا برای یافتن منابع جدید و بالقوه تحمل به تنش شوری استفاده شده است. ضرورت انجام چنین تحقیقی این بوده است که علیرغم تحقیقات فراوان در زمینه اصلاحات ژنتیکی و وجود مکانیسمهای سازگاری، بسیاری از گیاهان با مشکل کاهش عملکرد مواجه میباشند. یکی از عوامل اصلی کاهش عملکرد در گیاهان به ویژه گیاهان زراعی، اثرات سوء تنشهای غیر زنده است. از میان تنشهای غیر زنده، تنش شوری یکی از عوامل بسیار مهم کاهش عملکرد و هدر رفتن محصول گیاهی است. لذا، این تحقیق با هدف یافتن منابع بالقوه مقاومت به شوری در ژنوتیپهای جو اجرا گردیده است.

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید